Fiche : Les préparations microscopiques

1. L’ÉTAT FRAIS

L’état frais est un examen microscopique permettant d’observer des microorganismes vivants pour en déterminer la forme, le mode de groupement et la mobilité.

• Prélever à la pipette Pasteur (ou avec l’anse) une petite goutte d’un milieu liquide.
• Déposer la goutte au centre d’une lame propre et recouvrir d’une lamelle. Le liquide ne doit pas déborder de la lamelle (sinon jeter la lame dans la poubelle DASRI et recommencer).
• Observer immédiatement la préparation à l’objectif x40 en faible luminosité.

Technique : l’état frais est effectué à partir d’une culture en milieu liquide.

Interprétation à partir d’un bouillon bactérien : on peut observer :

• La mobilité des bactéries : attention une bactérie immobile est animée de mouvements browniens qu’il ne faut pas confondre avec la mobilité.
• La morphologie des bactéries et leur mode de groupement.
• L’abondance des différentes populations dans le cas d’un mélange.

2. RÉALISATION D’UN FROTTIS FIXÉ PUIS COLORATION AU BLEU DE MÉTHYLÈNE

⇨ Réalisation d’un frottis :

• Stériliser l'anse et la laisser refroidir.
• A partir d’une suspension bactérienne, prélever avec l'anse une goutte de suspension et l’étaler sur la lame en spirale. Possibilité de faire un frottis avec une goutte d’eau sur lame + colonie à dissocier (voir TP).
• Laisser sécher complètement le frottis dans la zone d’aseptie.
• Fixer le frottis à la flamme en écrasant rapidement la flamme du bec bunsen avec la lame ou en posant rapidement la lame sur le support du bec électrique (face sans frottis vers la flamme). Effectuer ce geste 2 à 3 fois.
• Laisser refroidir la lame avant de la colorer.

⇨ Coloration au bleu de méthylène :

• Recouvrir le frottis de bleu de méthylène. Laisser agir 1 à 2 minutes. Rincer à l’eau distillée puis sécher la lame à l’aide de papier sans la frotter. Observer au microscope à l’objectif x40 (mise au point) puis à l’objectif x100 en présence d’une goutte d’huile à immersion. Effectuer les réglages nécessaires afin d’augmenter la luminosité. → Les cellules apparaissent colorées en bleu, leur taille, forme, et éventuels groupements peuvent être décrits.